研究方向
发表时间:2013-11-28 阅读次数:13128次

1.  肿瘤和神经发育中蛋白质的O-糖基化调控

2. 蛋白质机器中的蛋白质O-糖基化修饰过程

3. 疾病糖链生物标志物

4.  人源糖蛋白的细菌合成

1. 肿瘤和神经发育中蛋白质O-糖基化的调控机制

(1) 发现脑组织和神经元特异性表达的ppGalNAc-T13,通过调控黏蛋白型O-糖蛋白podoplanin(PDPN)的初始O-GalNAc糖基化,稳定该蛋白在细胞中的分泌表达,从而促进神经元的分化。揭示了蛋白质O-GalNAc糖基转移酶在神经发育中的功能(J Biol Chem, 2016)。

(2) 在ppGalNAc-T酶的抑制剂研究中,发现天然黄酮多酚类小分子天然化合物木犀草素(luteolin)直接抑制ppGalNAc-T酶与受体底物多肽/蛋白的结合,通过选择性抑制不同家族成员的酶活,可特异性抑制淀粉样前体蛋白APP的O-糖基化,从而能降低阿尔兹海默病致病因子Aβ的产生,证明糖基转移酶是木犀草素的作用新靶点,提供了一种新的糖基转移酶抑制剂先导化合物结构,为揭示木犀草素在肿瘤以及神经变性型疾病中的作用机制提供了新的见解(J Biol Chem, 2017)。进一步研究发现以尿石素D为代表的天然单宁多酚类化合物可特异性抑制ppGalNAc-T酶催化活性,抑制肿瘤相关蛋白的O-GalNAc糖基化,改变结直肠癌肿瘤细胞迁移和侵袭的能力,揭示了多酚类化合物通过抑制糖基转移酶ppGalNAc-T,微调改变蛋白的O-GalNAc糖基化水平,产生相应生物学效应的机制。该研究为理解食品中多酚类物质干预疾病或具有保健作用的分子机制提供了新的见解(Bioorg Med Chem, 2019)。

图1. Luteolin抑制ppGalNAc-T并选择性调控APP的糖基化

2. 蛋白质机器中的蛋白质O-糖基化修饰过程

       在人体中,多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts家族由20个II型穿膜蛋白成员组成 (BBRC,2010),其中15种具有经典的O-GalNAc糖基转移酶催化活性,ppGalNAc-T普遍被认为定位在细胞的高尔基体并催化糖基化反应。然而,我们发现ppGalNAc-T18属于脊椎动物特有基因,表达在细胞内质网,表现出与其他高尔基体定位成员不同的亚细胞定位(Glycobiology, 2012)。ppGalNAc-T18虽然不具有经典的体外糖基转移酶催化活性,但却可以通过非酶促作用维持内质网稳态和促进细胞表面蛋白质的糖基化,提示内质网中可能存在新的蛋白质O-GalNAc糖基化调控机制(BBA Gen Subj, 2019)。近期最新成果证明ppGalNAc-T18通过其胞腔内的茎区及催化结构域与内质网中UGGT1, PLOD3和LPCAT1等蛋白的相互作用而驻留在内质网中(Glycobiology, 2021)。为理解糖基转移酶在维持细胞稳态和实现精准糖基化调控提供了基础。

图2. ppGalNAc-T18定位于内质网、及其相互作用蛋白

3. 胞内蛋白新型糖基化的发现和证明

       传统认识上,通常蛋白质的O-GalNAc糖基化主要发生在细胞分泌蛋白和膜蛋白上,胞内蛋白的糖基化修饰为O-GlcNAc糖基化修饰。 然而,通过代谢标记结合化学正交法的质谱检测技术,以肿瘤抑制因子p53为例,首次证明高等生物细胞的胞内核蛋白质上存在O-GalNAc糖基化修饰,同时发现在肿瘤细胞中p53蛋白Ser121位的O-GalNAc糖基化修饰抑制了p53的磷酸化水平,下调p53蛋白的稳定性从而抑制p53诱导的细胞凋亡。该成果揭示了p53蛋白上的O-GalNAc糖基化修饰在肿瘤细胞抑制细胞凋亡中的翻译后修饰调节的意义。核内蛋白p53上O-GalNAc糖基化修饰的确认,突破教课书上的普遍认知,为胞内蛋白具有新型O-GalNAc糖基化修饰提供了首个具体例证;刷新了人们对糖基化修饰复杂性和多样性的认知,为糖基化在生命体中扮演的角色提供了新的见解(BBA Gen Subj, 2020;Proteomics, 2017)。

图3. 胞内核蛋白p53上具有O-GalNAc糖基化修饰

4. 疾病糖链生物标志物

       结合我国临床诊疗需求,开发新型糖链生物标志物。拥有新型凝集素芯片、糖链亲和富集、质谱解析和临床数据统计分析等技术手段,研发基于糖链的疾病诊断/分子分型以及药物治疗预测等相关的临床血清生物标志物。评估诊断肝纤维化的血清糖蛋白AGP和M2BP等新型糖链标志物在临床上的应用价值(J Medical Virol, 2018;J Dig Dis, 2018;LiverInt, 2017;J Viral Hepat, 2017;Clin Proteomics, 2014),以及血浆中免疫球蛋白IgG上糖链结构在肺磨玻璃结节(GGN)病理发展过程中的特征变化及临床价值研究(Molecules, 2019)。

图4. 疾病糖链生物标志物的发现与临床评估

5.   人源糖蛋白的细菌合成

       开发了一种高效获得人源糖基转移酶的表达系统,通过共表达人源二硫键异构酶,在大肠杆菌中简便高效地获得具有底物选择性的ppGalNAc-T糖基转移酶。并利用该系统表达的活酶,成功地在白介素-2的天然糖基化位点Thr3残基上定点合成了O-糖基化修饰的白介素-2。该构建的大肠杆菌表达系统可以适用于富含二硫键的蛋白表达,并且为体外位点特异性合成O-糖蛋白药物提供了新的技术支持(BBRC, 2020)。

图5. 一种高效简便的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统

6. 功能糖组学技术开发与应用

(1) 利用糖供体探针的点击化学反应,结合蛋白质芯片技术检测糖基转移酶ppGalNAc-T的底物特性,系统性研究和发现O-GalNAc糖基化修饰蛋白,发现糖基转移酶的底物偏好性和选择性与进化趋势保持一致(Proteomics, 2017)。

图6. O-GalNAc糖基化修饰蛋白质的系统发现

(2) 开发了一种选择性富集叠氮标记糖肽和糖蛋白的纳米磁珠,利用细胞的代谢性糖标记和化学正交反应,实现复杂生物样品中糖肽和糖蛋白的特异性富集分离(Molecules, 2013; Chem Commun, 2012)。

(3) 建立基于凝集素识别的组织糖谱分析技术(Sci Rep, 2017;Mol BioSyst, 2014), 用于糖链生物标志物开发。

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