发表时间:2013-11-28 阅读次数:4984次

1、肿瘤功能糖生物学 :(糖基转移酶功能 、蛋白质O-GalNAc糖基化调控机制、糖链在肿瘤细胞中的变化规律和调控机制)
  肿瘤细胞的异常糖基化现象早已被报道,目前对这一现象所涉及的机理和造成的影响却仍然所知甚少。糖基转移酶是肿瘤细胞表面O-糖基化的基础,它决定着肿瘤细胞表面糖蛋白O-糖基化的数量和结构种类。本实验室从糖基转移酶着手,致力于阐明糖基化这一重要翻译后修饰与癌症的关系。
  我们研究发现了一种新的定位于内质网的蛋白质O-糖基化调控关键酶多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(ppGalNAc-T18),该酶只存在于脊椎动物,虽不具有经典的糖基化活性,但是可以选择性地促进同家族其他酶的糖基化活性,影响细胞表面蛋白的糖基化及细胞生长。该研究对教科书上关于蛋白质的O-GalNAc糖基化过程只发生在高尔基体中这一传统观念提出挑战,首次提出了内质网中可能存在新的蛋白质O-GalNAc糖基化调控机制。该成果发表在国际糖生物学研究领域权威杂志Glycobiology上(Glycobiology 2012, 22(5): 602-615)。

  图1.  (A) Veterbrate-specific T18 localized in ER rather than Golgi. (B) T18 lacks catalytic activity, but can selectively enhance the activity of other ppGalNAc-Ts. (C) Knockdown of T18 inhibited the cell growth, changed the cell morphology, and altered the cell O-glycosylation level.

 

2、疾病蛋白质组学和糖组学 (临床血清蛋白质组学和代谢组学 、蛋白质糖基化修饰系统生物学研究)
  随着分析技术的不断发展,蛋白质组学、代谢组学及糖组学研究为人类进行疾病的诊断防治和新药开发提供重要的理论基础。同时,研究疾病特异性蛋白质的翻译后修饰,为疾病提供了新的治疗方案。这些组学研究已经在医学领域中显示出其广泛的应用前景,而且其技术及应用还在不断突破中。    
1)临床血清蛋白质组学研究
  运用相对定量血清蛋白质组学和分子生物学研究技术,我们系统性地解析了不同分期结直肠癌病人血清、组织样本中细胞外基质组分--I型胶原蛋白在结直肠癌发生发展中的生物学行为。首次发现肿瘤病人血清中I型胶原蛋白的代谢性降解产物羧基末端肽(CTx)的含量与结直肠癌病人的分期呈正相关,血清中CTx的变化与病人的预后生存期相关。表明血清中CTx标志物检测对结直肠癌预后的临床诊断具有参考意义。研究提示伴随肿瘤生长所产生的代谢性特异降解多肽片段,是未来血清肿瘤生物标志物发现的重要目标候选分子群。研究同时为血清蛋白组学手段在临床检测上的应用提供了功能组织学佐证。该成果发表在欧洲蛋白质组学协会的Jounal of Proteomics杂志上(Jounal of Proteomics,2013,94:473-485)。

  
  图2.  Up-regulation of type I collagen during tumorigenesis of colorectal cancer revealed by quantitative proteomic analysis

2)临床代谢组学研究
  基于代谢组学技术平台,我们共鉴定出249种人体血清代谢物,并建立了具有良好预测能力的结直肠癌病人与健康对照者的判别模型。基于统计分析,我们最终筛选出6种与结直肠癌密切相关的具有代表性的候补代谢标志物,建立了具有临床应用探索价值的诊断模型。本研究中,我们系统地观察到了结直肠癌病人体内代谢紊乱的现象。并首次比较全面地从血清代谢谱上观察到结直肠癌病人体内异常加剧的脂肪酸合成与脂肪酸氧化代谢,该结果是对目前关于癌症有氧糖酵解(Warburg effect)现象的又一种重要补充。另外,我们还发现了具有结直肠癌特异性的肠道菌群代谢异常现象。这些结果将有助于揭示结直肠癌发病的分子机制,为结直肠癌的早期诊断、疗效评价、新药开发、及合理饮食提供重要参考依据。本研究的相关成果发表在Journal of Proteome Research杂志上(JPR 2012,11(2): 1354-1363;  JPR 2013,12(6): 3000-3009)。

3)蛋白质糖基化修饰系统生物学研究
  O-GalNAc糖基化的起始步骤由ppGalNAc-T家族催化完成。ppGalNAc-T家族在人体中有20个成员,其中15个具有催化活性。ppGalNAc-T家族成员具有不同的组织分布和底物特异性,共同对蛋白质O-糖基化进行调控。目前已经发现的O-糖蛋白还很少,为了发现更多O-糖蛋白,理解ppGalNAc-T和底物之间的作用关系,我们开发了一种高通量筛选ppGalNAc-T底物的方法。这种方法结合了蛋白质组芯片的高通量筛选能力和click反应的高特异性,使用ppGalNAc-T天然底物的类似物UDP-GalNAz作为供体底物,在芯片上进行糖基化反应后,使用炔基荧光探针来检测被糖基化的蛋白。我们用该方法对ppGalNAc-T2的底物进行筛选,得到了226个候选底物。这些候选底物中膜相关蛋白高度富集,但是也包括一些胞浆和核定位蛋白。我们对底物集中的p53和酪氨酸激酶相关通路中选择的候选底物在体外全部得到了验证。我们还通过质谱鉴定了p53的体外糖基化位点,并在细胞内发现p53确实有O-GaNAc糖基化修饰,但是其具体功能还有待进一步研究。这一方法也可以用于其它ppGalNAc-T成员的大规模底物筛选,得到ppGalNAc-T与底物的相互作用网络,帮助我们理解ppGalNAc-T家族的重要作用。

   图4. (A) Enzymatic reactions are performed ‘on-chip’ by ppGalNAc-T2 using UDP-GalNAz (left track) or UDP-GalNAc (right track) as donor substrate. After click chemistry reaction, GalNAz-modified proteins conjugated by alkyne-fluorophore are then detected by a fluorescence slide reader. (B) 226 proteins were identified as substrate candidates of ppGalNAc-T2. (C) 17 selected proteins from p53 network and Tyrosine kinase network were validated by HPA lectin blot in vitro. (D) The O-glycosylation site on p53 was identified by Mass Spectrometry.
  针对目前糖生物学研究中存在的高效特异性富集糖蛋白的技术难题,我们在利用磁性纳米材料的基础上,结合生物正交性标记和点击化学等方法,开发了具有选择性富集叠氮标记O-糖基化多肽及蛋白的炔基修饰纳米磁珠,建立了从复杂生物样品中分离富集糖基化蛋白的新方法,并成功应用于糖肽的质谱分析。该富集方法具有高效性和良好的特异性,有望为基于代谢标记的细胞动态糖基化研究提供一种方便有效的手段,也为化学和生物学交叉领域研究提供了新思路。该成果发表在英国皇家化学会的ChemComm杂志上(Chem. Commun., 2012,48:5907-5909)。

  图 5.  Capture and release of azido glycopeptides with DA-MSPs.
  
3、基于糖链生物标志物的疾病早期诊断技术
  糖链参与细胞识别、细胞分化、发育、信号转导、免疫应答等各种重要的生命活动。大量研究表明,肿瘤细胞的异常糖基化与肿瘤的发生发展密切相关。糖链有望成为诊断和治疗肿瘤等复杂性疾病的重要靶点。我们利用凝集素富集糖蛋白技术,质谱鉴定糖蛋白糖基化位点、糖链结构的技术,比较不同发展时期差异糖蛋白谱及糖链谱,并通过生物信息学分析筛选与疾病发生发展相关的标志糖蛋白及糖链结构,结合体内外分子生物学验证,将其应用临床大规模血清检测,实现对疾病的早期诊断。

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